用熒光疊氮化物探針通過CuAAC可視化炔烴標記的生物分子的一個主要缺點反應(yīng)是需要去除未反應(yīng)的熒光探針。當(dāng)對細胞內(nèi)環(huán)境、活體組織成像或?qū)w內(nèi)生物分子進行可視化時，這尤其成問題。去除所有未反應(yīng)的熒光探針的困難也是背景信號和非特異性結(jié)合的主要原因之一。

為了克服這一缺點，Carolyn Bertozzi小組設(shè)計了熒光疊氮化物探針，通過銅催化或無金屬點擊化學(xué)。這些疊氮化物探針在與炔烴反應(yīng)之前不具有熒光性。已終止在CalFluor中，這些探針具有從綠色到遠紅色波長的發(fā)射最大值，并且能夠?qū)崿F(xiàn)靈敏無洗滌條件下的生物分子檢測。許多報告表明，CalFluor探針是用于敏感可視化細胞中代謝標記分子（聚糖、DNA、RNA和蛋白質(zhì)）的工具，正在開發(fā)在不洗滌的條件下將動物腦組織切片、斑馬魚和小鼠腦組織切片。